Urodziła się jako Audrey Kathleen Ruston, była córką brytyjskiego bankiera Johna Victora Hepburn-Rustoniego i holenderskiej arystokratki, baronówny Elli van Heemstra. W późniejszym czasie jej ojciec dodał do swojego nazwiska drugi człon – Hepburn; w tym okresie przyszła aktorka nosiła nazwisko Hepburn-Ruston.
W 1951 wystąpiła po raz pierwszy w roli pierwszoplanowej w filmie Monte Carlo Baby. W tym samym roku występowała na Broadwayu w sztuce Gigi i za tę rolę otrzymała nagrodę dla najlepszej debiutantki roku. Po sześciomiesięcznym bardzo udanym sezonie w Nowym Jorku Hepburn zagrała wraz z Gregorym Peckiem w filmie Rzymskie wakacje. Otrzymała za tę rolę Oscara. W jej późniejszej karierze była jeszcze czterokrotnie nominowana w kategorii "najlepsza rola kobieca". Jej kreacja w Śniadaniu u Tiffaniego jest jedną z najbardziej znanych i słynnych ról w historii kina amerykańskiego.
Od 1967 Hepburn porzuciła karierę aktorską, decydując się występować sporadycznie i poświęciła się pracy jako specjalny ambasador UNICEF
Zmarła w 1993 na raka jelita, pochowana w Tolochenaz w Szwajcarii.